ПЦР-тестирование (также известное как тестирование полимеразной цепной реакции) — это тип лабораторного исследования, который сообщает, есть ли у кого-то в настоящее время COVID-19. Этот вид диагностики в отличие от экспресс-тестов, которые проверяют наличие антител в крови, выявляет непосредственно наличие вируса в организме.
ПЦР-тестирование проводится в лаборатории и может помочь найти даже крошечное количества вируса. Это достигается за счет усиления генетического материала вируса до уровня, на котором он может быть обнаружен. Для теста требуется образец от человека.
Этот образец собирается врачом, обычно с помощью тампона, вводимого человеку в нос или горло.
ПЦР-тесты используются для непосредственного определения наличия антигена, а не наличия иммунного ответа организма или антител. Обнаруживая вирусную РНК, которая будет присутствовать в организме до того, как сформируются антитела или появятся симптомы заболевания, тесты могут определить, есть ли у кого-то вирус на очень ранней стадии.
Кому и когда нужно проходить диагностику
ПЦР-тест на COVID-19 необходим, если:
- У вас есть симптомы COVID-19, такие как жар, кашель, усталость или затрудненное дыхание.
- У вас нет симптомов, но у вас был тесный контакт (в пределах 1,5 м в общей сложности 15 минут или более) с кем-то, у кого положительный результат теста на вирус COVID-19 или есть подозрение на его наличие.
Ваш врач, другой медицинский работник или отдел общественного здравоохранения порекомендуют пройти тест. Определенные группы считаются высокоприоритетными для диагностического тестирования. К ним относятся люди с признаками и симптомами COVID-19, которые:
- Работают в медицинском учреждении или в качестве служб быстрого реагирования.
- Живут или работают в учреждениях долгосрочного ухода, таких как дома престарелых, или других местах, где люди проживают вместе, например, в тюрьмах или приютах.
- Находятся на лечении в больнице.
Другим людям может быть предоставлен приоритет для тестирования в зависимости от рекомендаций местного департамента здравоохранения по мониторингу COVID-19 в отдельных сообществах.
Как работает ПЦР
ПЦР проводится в 3 основных этапа. Эти три шага повторяются в течение 30 или 40 циклов. Циклы выполняются на автоматическом циклическом устройстве, которое быстро нагревает и охлаждает пробирки, содержащие реакционную смесь.
Каждый этап – денатаурация (изменение структуры), отжиг (соединение) и растяжение — происходит при разной температуре:
- Денатурация: при 94 ° C (201,2 F) двухцепочечная ДНК плавится и раскрывается на два фрагмента одноцепочечной ДНК.
- Отжиг: при средних температурах, около 54 ° C (129,2 F), праймеры образуют пары (отжиг) с одноцепочечной «матрицей» (матрица — это последовательность ДНК, которую нужно скопировать). На небольшой длине двухцепочечной ДНК (объединенный праймер и шаблон), полимераза присоединяется и начинает копировать шаблон.
- Удлинение: при 72 ° C (161,6 ° F) лучше всего работает полимераза, и строительные блоки ДНК, комплементарные матрице, соединяются с праймером, образуя двухцепочечную молекулу ДНК.
За один цикл одиночный сегмент двухцепочечной ДНК-матрицы амплифицируется в два отдельных фрагмента двухцепочечной ДНК. Эти две части затем доступны для усиления в следующем цикле. По мере повторения циклов создается все больше и больше копий, а количество копий шаблона увеличивается в геометрической прогрессии.
На последнем, четвертом этапе к рецепторным участкам на РНК присоединяется индикатор, который, затем, окрашивается на контрольном и/или тестовом участке тест-кассеты.
Как проводится диагностика
Для диагностического теста на COVID-19 медицинский работник берет образец слизи из носа, горла или образец слюны.
Образец, необходимый для диагностического тестирования, можно взять в кабинете врача, в медицинском учреждении, в центре тестирования или на дому (а некоторых ситуациях выезд лаборанта возможен на дом). Рекомендуется использовать длинный мазок из носа (мазок из носоглотки), хотя мазок из зева приемлем.
Врач или другой медицинский работник вставляет в нос пациента тонкую гибкую палочку с ватой на кончике или проводит тампоном по задней стенке горла, чтобы собрать образец слизи. Это может быть несколько неприятно.
Что касается пробы из носа, мазок может производиться в обеих ноздрях, чтобы собрать достаточно слизи для анализа. Тампон ненадолго остается на месте, прежде чем его осторожно поворачивают при извлечении. Образец герметично закрывается в пробирке и отправляется в лабораторию для анализа.
Что влияет на результат тестирования
Технические проблемы, включая загрязнение во время отбора проб (например, тампон случайно касается загрязненной перчатки или поверхности), загрязнение ампликонами ПЦР, загрязнение реагентов, перекрестное загрязнение образца и перекрестные реакции с другими вирусами или генетическим материалом — основные причины ложных результатов исследования.
Но кроме технических проблем на информативность исследования влияет правильная подготовка. Пациент должен быть проинформирован о том, что за 4 часа до тестирования он не может курить, есть, жевать жвачку, чистить зубы или полоскать рот ополаскивателем.
Современная альтернатива ПЦР
Более современным и удобным способом тестирования на вирусные антигены является экспресс-тестирование, которое использует ту же индикаторную реакцию, что и классический ПЦР тест, но без первых трех этапов, связанных с повышением количества специфических отрезков вирусной РНК. Это стало возможным благодаря более чувствительному индикатору. Использование этих тестов заметно сокращает время тестирования (время проведения теста — всего 15 минут)
Приобрести экспресс тесты на выявление вирусных антигенов можно по ссылке: ПЦР Тест мазок Сovid 19 для выявления антигена коронавируса Экспресс-тест на COVID-19 (коронавирус) N-COV-19 RAPID (Великобритания)
03.12.2020 Белянчиков Юрий
ПЦР-тест — что это такое простыми словами, что показывает ПЦР анализ и когда назначается
ПЦР расшифровывается как «полимеразная цепная реакция». Это метод лабораторной диагностики, цель которого заключается в выявлении возбудителя инфекционного заболевания.
Он является золотым стандартом в диагностике возбудителей, который был многократно проверен.
ПЦР дает возможность определить патогенный микроорганизм даже в том случае, если в исследуемом материале присутствует всего несколько его молекул ДНК.
Как работает ПЦР-анализ?
Практически все живые существа на планете, исключая некоторые вирусы с РНК-геномами, имеют генетический материал, представленный длинной двухцепочной молекулой ДНК. Цепочка ДНК включает нуклеотиды — небольшие молекулы с универсальным строением. Они могут идти в цепочке ДНК в разном порядке. В зависимости от этого «собираются» разные геномы.
У каждого болезнетворного микроорганизма есть свой, уникальный порядок построения цепочки ДНК, поэтому его невозможно спутать с ДНК человека.
При проведении теста ПЦР используют фрагмент чужеродного генетического материала, добытый из образца, и размножают много раз с помощью белка-фермента. За несколько часов количество копий увеличивается в несколько миллиардов раз. Это позволяет получить такое количество ДНК, которого достаточно для успешного определения его природы.
В лабораториях используют определенный набор реактивов для каждого конкретного микроорганизма, поэтому пациентам назначают не общий ПЦР-анализ, а тест на конкретный микроорганизм (например, на вирус гепатита С).
Полимеразная цепная реакция проводится качественно и количественно. Качественный тест позволяет определить, есть ли в образце генетический материал микроорганизма (вируса или бактерии), который ищет врач. Количественный тест дает информацию о том, в каком количестве содержится материал.
Преимущества ПЦР-анализа
К достоинствам этого диагностического метода относят:
- Универсальность. ПЦР-тест обнаруживает любые ДНК и РНК, даже в тех случаях, если другие диагностические методы не дали результата.
- Эффективность. Полимеразная цепная реакция позволяет диагностировать некультивируемые, трудно культивируемые и латентно существующие формы патогенных микроорганизмов.
- Высокую чувствительность. Даже если в исследуемом материале присутствует всего один фрагмент генетического материала возбудителя, тест все равно показывает его.
- Высокую специфичность метода, достигающую 100%. В ходе диагностики выявляют уникальную последовательность нуклеотидов в цепочке ДНК, характерную только для конкретного патогенного микроорганизма, провоцирующего развитие заболевания.
- Высокую скорость выполнения. Для установки реакции достаточно несколько часов. Пациент получает результаты анализа на следующий день после сдачи.
ПЦР-тест направлен на определение возбудителя заболевания, а не на реакцию на его проникновение со стороны организма.
Показания к проведению ПЦР-теста
Анализ проводят при инфекционных заболеваниях для определения природы их возбудителя. Также его назначают при:
- необходимости точно установить конкретный болезнетворный микроорганизм;
- диагностике лейкоза и других злокачественных новообразований;
- диагностике некоторых генетически обусловленных заболеваний;
- исследовании образцов биопсии, которые невозможно изучить с помощью других методов.
С помощью ПЦР-анализа выявляют различные заболевания:
- инфекционные (ВИЧ, гепатит, ТОРЧ-инфекции и т.д.);
- передающиеся половым путем (хламидии, микоплазмы, кандиды);
- внутриутробные инфекции (вирусы краснухи, герпеса, токсоплазмы);
- респираторные (в настоящее время ПЦР-тест является золотым стандартом в диагностике вируса Ковид-19);
- генетические.
С помощью ПЦР можно провести тест на определение отцовства.
Типы ПЦР
Диагностика на основе полимеразной цепной реакции имеет несколько разновидностей. Она может быть:
- инвертированной;
- с обратной транскрипцией;
- количественной;
- вложенной;
- ступенчатой.
Наиболее надежный метод — ПЦР в режиме реального времени. Это количественный или полуколичественный способ диагностики, который предусматривает постоянное наблюдение образца генетического материала датчиком. Последний регистрирует сигналы на каждом цикле реакции.
Подготовка к анализу
При подготовке к ПЦР-анализу нужно соблюдать несколько правил:
- За 10-14 дней до назначенного теста прекратить прием любых препаратов и отказаться от проведения лечебных процедур, включая физиотерапевтические. Если прием лекарственных средств жизненно необходим, об этом нужно предупредить врача заранее.
- В случае забора мазка на выявление заболеваний, передающихся половым путем, нужно в течение суток перед исследованием отказаться от спринцеваний, использования тампонов и лечебных суппозиториев, применения антисептических средств. Также в этот период необходимо воздерживаться от половых актов. За 2 часа до забора мазка нельзя мочиться.
- Если выполняется забор мазка из зева, за 3 часа до анализа нельзя чистить зубы, пить, полоскать рот (даже простой водой).
- За трое суток до сдачи материала на ПЦР-исследование нужно полностью отказаться от употребления алкоголя.
- За двое суток до проведения теста нужно исключить повышенные физические нагрузки.
Материалы для ПЦР-анализа
В зависимости от направленности теста ПЦР, в качестве материала для исследования используют:
- кровь (сыворотка или плазма);
- соскобы эпителиальных клеток (с кожных покровов, слизистой оболочки уретры, цервикального канала);
- различные биологические жидкости (околоплодная, суставная, спинномозговая жидкости, секрет предстательной железы);
- мазок из зева;
- различные биологические выделения (слюна, моча, мокрота);
- биоптат (материал, полученный путем проведения биопсии).
Расшифровка результатов ПЦР-тестирования
Результат ПЦР-анализа либо положительный, либо отрицательный. Положительный указывает на то, что у человека присутствуют фрагменты ДНК возбудителя заболевания, то есть, что человек заражен и ему необходимо лечение. Отрицательный результат ПЦР-анализа свидетельствует об отсутствии следов ДНК патогена. В таком случае человек здоров.
В некоторых случаях ПЦР-тест дает положительный результат, хотя человек не ощущает недомогания и специфических симптомов заражения. Это значит, что заболевание выявлено на ранней стадии развития. Для уточнения диагноза назначают дополнительные исследования, а затем, с учетом их результата, начинают курс лечения.
О видах исследований на новую коронавирусную инфекцию covid-19
О видах исследований на новую коронавирусную инфекцию covid-19
Сегодня наиболее актуальной задачей общественного здравоохранения является обеспечение безопасности населения Российской Федерации. С этой целью проводится массовое тестирование населения на коронавирусную инфекцию.
Оно позволяет выявить как заболевших (на любой стадии заболевания), так и бессимптомных носителей. В настоящее время существует несколько видов исследований, у каждого из которых свои цели и назначения.
Все исследования можно разделить на две большие группы: прямые – обнаружение возбудителя и непрямые – обнаружение иммунного ответа человека на контакт с возбудителем.
Прямые методы
1. Молекулярная диагностика — обнаружение РНК (генетического материала) коронавируса.
Этот тест предназначен для диагностики коронавирусной инфекции как у пациентов, у которых есть симптомы респираторной инфекции, так и у лиц без симптомов заболевания.
Для исследования проводится взятие мазка из носоглотки и ротоглотки, после чего проба направляется в лабораторию, где методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) определяется наличие, либо отсутствие генетического материала коронавируса SARS-CoV-2 (РНК).
Если в пробе РНК коронавируса не обнаруживается, то это означает, что на момент взятия мазка – пациент не инфицирован. Формат ответа при проведении ПЦР тестирования может быть качественный: обнаружено/не обнаружено.
И количественный – с указанием уровня вирусной нагрузки.
Метод ПЦР отличается высокой чувствительностью, и исследование информативно для выявления всех известных на данный момент штаммов коронавируса SARS-CoV-2, в том числе и для штамма Омикрон.
Возможны ли отрицательные результаты исследования, в том случае, если пациент болен или является носителем? Да, в редких случаях это возможно.
Причин для этого несколько: низкая вирусная нагрузка (слишком малое количество вируса в верхних дыхательных путях), поздние стадии заболевания, когда у пациента есть поражение легких (вирус «спустился» из носоглотки в легкие).
И, к сожалению, человеческий фактор – при неправильном взятии биологического материала: взятие мазка из носовых ходов и ротовой полости, а не носоглотки/ротоглотки.
2. Обнаружение антигенов коронавируса (экспресс-тесты).
Антигены – белковые частицы коронавируса SARS-CoV-2
Вирусные антигены – это белки, входящие в состав вируса, которые распознаются иммунной системой нашего организма. Тест на выявление антигенов коронавируса SARS-CoV-2 так же используется для диагностики COVID-19 как у пациентов с симптомами респираторной инфекции, так и у бессимптомных лиц.
Экспресс-тесты на выявление антигенов коронавируса достаточно просты в использовании, а их проведение не требует специальной лаборатории, больших временных затрат (как правило результат готов уже через 15-30 минут). Специальных навыков для поведения экспресс-тестирования так же не требуется.
Именно по этой причине экспресс-тесты на антигены коронавируса часто используются в учебных заведениях, на рабочих местах, в пунктах экспресс-тестирования в общественных местах, а также непосредственно на приеме врача. Если в результате исследования антигены коронавируса не обнаруживаются, это означает, что на момент проведения теста пациент не инфицирован.
Впрочем, аналитическая чувствительность экспресс-теста несколько ниже, чем у метода ПЦР, поэтому если результат исследования отрицательный, а у пациента есть симптомы заболевания COVID-19, то врач обязательно назначит дополнительный тест методом ПЦР. В случае, если результат исследования положительный — это свидетельствует об инфицировании коронавирусом SARS-CoV-2.
Как и ПЦР тест, отрицательный результат теста на антигены коронавирусы свидетельствует об отсутствии инфекции лишь на момент проведения исследования.
Возможны ли отрицательные результаты исследования, в том случае, если пациент болен или является носителем? Да, это возможно, и причины здесь схожи с ПЦР тестированием: низкая вирусная нагрузка, поздние стадии заболевания, неправильное взятие биологического материала. Современные экспресс-тесты информативны для диагностики COVID-19 вне зависимости от того, каким штаммом коронавируса произошло инфицирование.
Непрямые методы исследования – обнаружение антител (иммуноглобулинов) против коронавируса SARS-CoV-2 в крови пациента.
Антитела, или иммуноглобулины — это белки, которые вырабатывает наша иммунная система в результате в результате инфицирования коронавирусом SARS-CoV-2. Причем антитела вырабатываются вне зависимости от того были симптомы COVID-19, или пациент перенес заболевание бессимптомно.1. IgM – «ранние» антитела, вырабатываются в самом начале заболевания и начинают обнаруживаются при исследовании крови уже на 5-7 сутки. Длительность циркуляции IgM после COVID-19 как правило составляет около 2 месяцев, но у некоторых пациентов они выявляются в течение нескольких месяцев после заболевания. Поэтому, при их обнаружении без проведения ПЦР тестирования нельзя судить о наличии острой инфекции в настоящий момент. Диагноз COVID-19 может быть подтвержден только прямыми методами диагностики – выявление РНК коронавируса, либо его антигенов.
2. IgG – «поздние» антитела, начинают вырабатываться на 2-3 неделе заболевания, но у некоторых пациентов, они могут обнаруживаться одновременно с IgM в более ранние сроки.
Но для полного понимания о формировании иммунного ответа против коронавирусной инфекции важно понимать не только, какой класс иммуноглобулинов IgM/ IgG выработались у пациента. Но и каким конкретно белкам коронавируса эти антитела сформировались.
Антитела к нуклеокапсидному белку коронавируса (белку, расположенному внутри вируса) – формируются после перенесенного заболевания, но, к сожалению, не обладают свойствами препятствовать инфицированию.
И их обнаружение нам говорит лишь о том, что пациент перенес COVID-19 ранее – это важно понимать в рамках оценки эпидемиологической ситуации: сколько пациентов нашей страны переболели, в том числе бессимптомно.
Антитела к spike-белку (белку оболочки вируса, благодаря которому вирус способен прикрепиться к клеткам нашего организма, тем самым осуществляя инфицирование). Обнаружение антител к spike-белку (либо его субъединицам) формируются как после перенесенного заболевания, так и после вакцинации.
И, самое главное, что антитела к spike-белку являются нейтрализующими, то есть могут препятствовать инфицированию коронавирусом. К сожалению, на данный момент нет окончательных данных о том, как долго циркулируют нейтрализующие антитела, и какой их уровень препятствует заражению.
И самым надежным методом защиты от COVID-19 остается вакцинация!
Результат исследования на антитела может быть качественный: обнаружено/не обнаружено. И количественный – с указанием уровня антител в единицах BAU.
BAU («binding antibody units» — единицы связывающих антител) – единицы, принятые первым международным стандартом ВОЗ.
Что выбрать: ПЦР-тест или тест на антитела к COVID-19?
С начала 2020 года коронавирусная инфекция (COVID-19) стремительно распространилась по всему миру. И с каждым днем все больше людей осознает, что это заболевание совсем рядом и никто на 100% не застрахован от него. В особой зоне риска находятся те, кто работает вне дома.
Проблема в том, что после заражения может пройти неделя, прежде чем возникнут первые симптомы, и все это время вы будете распространителем вируса. Кроме того, COVID-19 может протекать бессимптомно. Поэтому-то и необходимо проходить тестирование, которое поможет вовремя обнаружить болезнь и принять меры, чтобы не заразить окружающих. Таким образом можно сдержать распространение пандемии.
В лицензированных частных клиниках вы можете пройти 2 вида тестирования — так называемый ПЦР-тест и тест на антитела. Но какой из них лучше выбрать и какой точнее? Рассмотрим особенности каждого из них, чтобы найти ответ.
Что такое ПЦР-тест и для чего его сдают
ПЦР расшифровывается как “полимеразная цепная реакция”. Такой метод диагностики направлен на обнаружение РНК коронавируса COVID-19. Анализ проводят по биоматериалу, взятому из носа или зева пациента. Сюда клетки вируса попадают первым делом, поэтому тест будет эффективен с первых дней.
Мазок берут в клинике, но само лабораторное исследование проводится в Государственном научном центре дерматовенерологии. Для проверки на вирус используется тест-система от этого же Государственного научного центра дерматовенерологии. Результаты анализа можно получить через 3 дня.
Возможно бесконтактное проведение процедуры (вам передают набор для взятия мазка и вы потом передаете его так же бесконтактно медикам).
ПЦР-тест позволяет установить, что инфекция находится в организме в данный момент. В заключении будет лишь указано, выявлен возбудитель или нет. Вы не сможете узнать стадию и наличие антител, которые свидетельствуют о том, что человек уже переболел COVID-19. Для этого предназначен тест на антитела.
Какую информацию дает тест на антитела
Тест на антитела проводят иммуноферментным методом по анализу крови из вены тоже в лаборатории Государственного научного центра дерматовенерологии. При этом определяют не наличие самого вируса, а наличие антител к нему. Для борьбы с коронавирусом COVID-19 организм вырабатывает особенные иммуноглобулины — IgM и IgG.
Во время теста подсчитывается их количество для установления стадии заболевания. Возможно проведение теста на один из видов антител или оба (второй вариант более информативный, поэтому он предпочтительнее).
Первый тип антител, IgM, выделяется в организме с первых дней развития болезни, что происходит на 2-7 день после заражения. Они остаются в крови около 1-2 недель, а после выздоровления исчезают. Что означает положительный результат на антитела IgM? Вариантов может быть несколько, в зависимости от подсчитанного количества:
- если иммуноглобулинов данного типа немного, то COVID-19 находится на начальном этапе развития;
- если количество зашкаливает, значит сейчас острая фаза. В это время человек все еще является разносчиком инфекции, даже если у него нет никаких симптомов;
- присутствие IgM в небольшом количестве в сочетании с IgG указывает на завершение болезни.
Иммуноглобулин типа G производится в острой стадии и остается в крови после выздоровления, обеспечивая иммунитет длительное время. Если тест показал наличие антител к коронавирусу типа IgG, значит у вас уже есть иммунитет к данному заболеванию и вы не представляете опасности для окружающих. Небольшое количество иммуноглобулинов свидетельствует о том, что вы переболели недавно.
Какой тест сдавать?
Оба варианта тестов являются эффективными, но в большинстве случаев мы рекомендуем делать тест на антитела, так как он более универсальный.
Преимущества теста на антитела (IgM, IgG) к COVID-19 перед ПЦР-тестом:
- Информативность — Тест показывает не только, заражены вы или нет, но еще и стадию заболевания, а также помогает установить факт перенесенного ранее COVID-19.
- Быстрее — Сейчас в лабораториях большие очереди по ПЦР-тестам и результатов можно ждать от 3 до 5 дней. По антитела результаты будут готово в течение 3-х дней.
- Доступность — ПЦР-тест стоит дороже, так как тест-системы более дорогие.
- Подходит для юридических лиц — Вы сможете установить, кто из работников компании/предприятия уже переболел, чтобы не тестировать их каждый раз снова.
ПЦР-тест необходим для того, чтобы выявить инфекцию на ранней стадии, до развития иммунного ответа. Его рекомендуют делать в тех случаях, когда тест на антитела дал отрицательный или неоднозначный результат. Если вам трудно определиться с выбором и вы хотите получить полную картину, не теряя лишнее время, то сразу делайте 2 теста. Это самый лучший вариант.
Зачем проводить тест на коронавирус
Коронавирус COVID-19 часто протекает незаметно, человек может не испытывать никаких симптомов, но при этом заражать окружающих.
Неизвестно, как отреагирует организм другого зараженного, а ведь в некоторых случаях все заканчивается аппаратом искусственной вентиляции легких.
Если вы будете проходить периодическое тестирование, то сможете своевременно обнаружить инфекцию и принять меры по самоизоляции, чтобы не заразить близких.
Если у вас не обнаружены антитела, то вы еще не болели COVID-19, а значит нужно быть аккуратным, придерживаясь рекомендаций ВОЗ. Те же, кто переболел, могут быть более спокойными, так как ученые склоняются к мнению, что антитела дают защиту от повторного заражения.
Также вы можете пройти тест, если контактировали с больным и хотите проверить, был ли выработан в организме иммунитет (только важно переждать 2 недели после последнего контакта).
Где можно пройти ПЦР-тест на коронавирус и тест на антитела
ПЦР-тест и тест на антитела можно пройти в клиниках Москвы и Московской области. Подобрать удобную по расположению для вас клинику и сравнить цены в разных медцентрах вы можете с помощью сервиса VMEDIC: Тест на COVID-19.
ПЦР: что это такое? Диагностика инфекционных заболеваний методом полимеразной цепной реакции
Информацию из данного раздела нельзя использовать для самодиагностики и самолечения. В случае боли или иного обострения заболевания диагностические исследования должен назначать только лечащий врач. Для постановки диагноза и правильного назначения лечения следует обращаться к Вашему лечащему врачу.
В конце статьи см. словарь Полимеразную цепную реакцию (ПЦР, PCR) изобрёл в 1983 году Кэри Мюллис (американский учёный). Впоследствии он получил за это изобретение Нобелевскую премию. В настоящее время ПЦР-диагностика является, одним из самых точных и чувствительных методов диагностики инфекционных заболеваний. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — экспериментальный метод молекулярной биологии, способ значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК) в биологическом материале (пробе). В основе метода ПЦР лежит многократное удвоение определённого участка ДНК при помощи ферментов в искусственных условиях (in vitro). В результате нарабатываются количества ДНК, достаточные для визуальной детекции. При этом происходит копирование только того участка, который удовлетворяет заданным условиям, и только в том случае, если он присутствует в исследуемом образце. Кроме простого увеличения числа копий ДНК (этот процесс называется амплификацией), ПЦР позволяет производить множество других манипуляций с генетическим материалом (введение мутаций, сращивание фрагментов ДНК), и широко используется в биологической и медицинской практике, например, для диагностики заболеваний (наследственных, инфекционных), для установления отцовства, для клонирования генов, введения мутаций, выделения новых генов.
Специфичность и применение
ПЦР — метод молекулярной диагностики, ставший для ряда инфекций «золотым стандартом», проверен временем и тщательно апробирован клинически. Метод ПЦР позволяет определить наличие возбудителя заболевания, даже если в пробе присутствует всего несколько молекул ДНК возбудителя.
ПЦР позволяет диагностировать наличие долго растущих возбудителей, не прибегая к трудоёмким микробиологическим методам, что особенно актуально в гинекологии и урологии при диагностике урогенитальных инфекций, передающихся половым путем (ИППП).
- Исследование урогенитального тракта методом ПЦР на ИППП ;
Также, этим методом проводят диагностику вирусных инфекций, таких как гепатиты, ВИЧ, коронавирус COVID-19 и др. Чувствительность метода значительно превосходит таковую у иммунохомических и микробиологических методов, а принцип метода позволяет диагностировать наличие инфекций со значительной антигенной изменчивостью.
- тест методом ПЦР на коронавирус Covid-19, мазок из носа и зева на определение РНК вируса SARS-CoV-2;
Специфичность ПЦР при использовании технологии PCR даже для всех вирусных, хламидийных, микоплазменных, уреаплазменных и большинства других бактериальных инфекций достигает 100%. Метод ПЦР позволяет выявлять даже единичные клетки бактерий или вирусов. ПЦР-диагностика обнаруживает наличие возбудителей инфекционных заболеваний в тех случаях, когда другими методами (иммунологическими, бактериологическими, микроскопическими) это сделать невозможно. Особенно эффективен метод ПЦР для диагностики трудно культивируемых, некультивируемых и скрыто существующих форм микроорганизмов, с которыми часто приходится сталкиваться при латентных и хронических инфекциях, поскольку этот метод позволяет избежать сложностей, связанных с выращиванием таких микроорганизмов в лабораторных условиях. Применение ПЦР-диагностики также очень эффективно в отношении возбудителей с высокой антигенной изменчивостью и внутриклеточных паразитов. Методом ПЦР возможно выявление возбудителей не только в клиническом материале, полученном от больного, но и в материале, получаемом из объектов внешней среды (вода, почва и т. д.). В урологической и гинекологической практике — для выявления хламидиоза, уреаплазмоза, гонореи, герпеса, гарднереллёза, микоплазменной инфекции, ВПЧ — вирусов папилломы человека; в пульмонологии — для дифференциальной диагностики вирусных и бактериальных пневмоний, туберкулёза; в гастроэнтерологии — для выявления хеликобактериоза; в клинике инфекционных заболеваний — в качестве экспресс-метода диагностики сальмонеллёза, дифтерии, вирусных гепатитов В, С и G; в гематологии — для выявления цитомегаловирусной инфекции, онковирусов. Специфичность ПЦР основана на образовании комплементарных комплексов между матрицей и праймерами — короткими синтетическими олигонуклеотидами длиной 18 — 30 букв. Каждый из праймеров сопоставим (комплементарен) с одной из цепей двуцепочечной матрицы, обрамляя начало и конец амплифицируемого участка. После соединения (гибридизации) матрицы с праймером (отжиг), последний служит затравкой для ДНК-полимеразы при синтезе комплементарной цепи матрицы.
Проведение ПЦР
Для проведения ПЦР в простейшем случае требуются следующие компоненты:
- ДНК-матрица, содержащая тот участок ДНК, который требуется амплифицировать;
- два праймера, комплементарные концам требуемого фрагмента;
- термостабильная ДНК-полимераза;
- дезоксинуклеотидтрифосфаты (A, G, C, T);
- ионы Mg2+, необходимые для работы полимеразы;
- буферный раствор.
ПЦР проводят в амплификаторе — приборе, обеспечивающем периодическое охлаждение и нагревание пробирок, обычно с точностью не менее 0,1°C. Чтобы избежать испарения реакционной смеси, в пробирку добавляют высококипящее масло, например, вазелиновое. Добавление специфичеких ферментов может увеличить выход ПЦР-реакции. Ход реакции
Обычно при проведении ПЦР выполняется 20 — 35 циклов, каждый из которых состоит из трех стадий.
Двухцепочечную ДНК-матрицу нагревают до 94 — 96°C (или до 98°C, если используется особенно термостабильная полимераза) на 0,5 — 2 минуты, чтобы цепи ДНК разошлись.
Эта стадия называется денатурацией — разрушаются водородные связи между двумя цепями. Иногда перед первым циклом проводят предварительный прогрев реакционной смеси в течение 2 — 5 минут для полной денатурации матрицы и праймеров.
Когда цепи разошлись, температуру понижают, чтобы праймеры могли связаться с одноцепочечной матрицей. Эта стадия называется отжигом. Температура отжига зависит от праймеров и обычно выбирается на 4 — 5°С ниже их температуры плавления. Время стадии — 0,5 — 2 минут.
ДНК-полимераза реплицирует матричную цепь, используя праймер в качестве затравки. Это — стадия элонгации. Температура элонгации зависит от полимеразы. Часто используемые полимеразы наиболее активны при 72°C.
Время элонгации зависит как от типа ДНК-полимеразы, так и от длины амплифицируемого фрагмента. Обычно время элонгации принимают равным одной минуте на каждую тысячу пар оснований.
После окончания всех циклов часто проводят дополнительную стадию финальной элонгации, чтобы достроить все одноцепочечные фрагменты. Эта стадия длится 10 — 15 мин.
Подготовка материала к исследованию и транспорт его в лабораторию Для успешного проведения анализа важно правильно собрать материал у пациента и правильно провести его подготовку. Известно, что в лабораторной диагностике большинство ошибок (до 70%) совершается именно на этапе пробоподготовки. Для взятия крови в лаборатории ИНВИТРО в настоящее время применяются вакуумные системы, которые с одной стороны минимально травмируют пациента, а с другой — позволяют произвести взятие материала таким образом, что он не контактирует ни с персоналом, ни с окружающей средой. Это позволяет избежать контаминации (загрязнения) материала и обеспечивает объективность анализа ПЦР.
Словарь
ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота — биологический полимер, один из двух типов нуклеиновых кислот, обеспечивающих хранение, передачу из поколения в поколение и реализацию генетической программы развития и функционирования живых организмов. Основная роль ДНК в клетках — долговременное хранение информации о структуре РНК и белков.
РНК– рибонуклеиновая кислота — биологический полимер, близкий по своему химическому строению к ДНК. Молекула РНК построена из тех же мономерных звеньев — нуклеотидов, что и ДНК. В природе РНК, как правило, существует в виде одиночной цепочки. У некоторых вирусов РНК является носителем генетической информации. В клетке играет важную роль при передаче информации от ДНК к белку.
РНК синтезируется на ДНК-матрице. Процесс этот называется транскрипцией. В ДНК имеются участки, где содержится информация, ответственная за синтез трех видов РНК, различающихся по выполняемым функциям: информационной или матричной РНК (мРНК), рибосомальной (рРНК) и транспортной (тРНК). Все три вида РНК тем или иным способом участвуют в синтезе белка.
Однако информация по синтезу белка содержится только в мРНК.
Нуклеоти́ды — основная повторяющаяся единица в молекулах нуклеиновых кислот, продукт химического соединения азотистого основания, пятиуглеродного сахара (пентозы) и одной или нескольких фосфатных групп.
Нуклеотиды, представленные в нуклеиновых кислотах, содержат одну фосфатную группу.
Они называются по содержащемуся в них азотистому основанию — адениновый (A), содержащий аденин, гуаниновый (G) — гуанин, цитозиновый (C) — цитозин, тиминовый (Т) — тимин, урациловый (U) — урацил.
В состав ДНК входят 4 типа нуклеотидов — A, T, G, C, в состав РНК также 4 типа — A, U, G, C. Сахаром в составе всех нуклеотидов ДНК является дезоксирибоза, РНК — рибоза. При образовании нуклеиновых кислот нуклеотиды, связываясь, образуют сахаро-фосфатный остов молекулы, по одну сторону которого находятся основания.
Праймер – котроткая ДНК, используемая для репликации матричной цепи. Каждый из праймеров комплементарен одной из цепей двуцепочечной матрицы, обрамляя начало и конец амплифицируемого участка.
Литература
- Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. Пер. с англ. — М.: Мир, 2002. — 589 с., илл. ISBN 5-03-003328-9
3 вида тестов на коронавирус: преимущества и различия методов в частной клинике
Быстрая и надежная диагностика Covid-19 – это первый шаг к его лечению и профилактике. Чтобы определить наличие вируса в организме, применяются разные методы исследования.
К ним относится экспресс-тестирование на антитела, методика ПЦР и LAMP.
Здесь всего за несколько минут вы сможете узнать, какой из этих тестов более эффективный, как они проводятся и сколько занимают по времени.
ПЦР-тест
Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) является более точным способом выявления инфекции Covid-19.
В отличие от других способов диагностики он направлен не на обнаружение антител, вырабатываемых организмом при заболевании, а непосредственно на сам вирус.
Это позволяет определить, болеет человек коронавирусной инфекцией в настоящий момент или нет. ПЦР-тест наиболее эффективен в том случае, если он сделан в течение 7-10 дней с возникновения первых симптомов инфекционного заболевания.
Как проводится тест ПЦР? Забор биоматериала из носоглотки для исследования производится при помощи тампона. Для этого необходимо обратиться в лабораторию или вызвать специалистов частной клиники на дом (например, если вы не хотите контактировать с другими людьми).
Кому рекомендуется тестирование ПЦР? Если вы контактировали с человеком, болеющим Covid-19.
Через сколько будут известны результаты исследования? В среднем, для получения результатов необходимо около 24 часов. При обращении в государственные лаборатории срок ожидания может увеличиться до 2-3 дней и более.
Насколько точно тестирование ПЦР? Это самый надежный метод выявления Covid-19. По данным исследований, клиническая чувствительность тестов составляет около 80%, поэтому получение ложноотрицательного или ложноположительного результата сведено к минимуму.
Тест на антитела к Covid-19
При проникновении вируса в организм иммунная система начинает вырабатывать специфические антитела (Ig – иммуноглобулины), предназначенные для защиты от инфекции. Тесты на антитела к Covid-19 определяют их наличие и поэтому позволяют узнать, болеет человек коронавирусом или уже переболел ранее.
Всего в организме человек существует 5 видов антител: IgM, IgG, IgA, IgD, IgE. В основном, при коронавирусной инфекции вырабатываются:
- IgM. Это первые иммуноглобулины, которые появляются в течение 3-5 дней после инфицирования и остаются в организме до 30-35 дней. Это означает, что обнаружить иммуноглобулины М можно только в течение инкубационного периода и во время болезни.
- IgG. Они начинают вырабатываться позднее, и являются основными антителами, нейтрализующими вирус. Остаются в организме в течение нескольких месяцев и даже лет. Это означает, что обнаружить иммуноглобулины G можно только в течение заболевания и после выздоровления.
Для тестирования на антитела применяется иммуноферментный (ИФА) либо иммунохемилюминесцентный (ИФЛА) анализ. Это экспресс-тестирование, показывающее количество антител IgM и IgG. Проводится в лаборатории или в домашних условиях, если вызвать специалистов частной клиники для забора биоматериала на дом.
Как проводится скрининг? Применяется образец крови, взятой из вены или пальца. Биоматериал и специальный раствор наносится на тест-карту. Результат определяется после полного проявления цветных полос, количество и расположение которых указывает на наличие иммуноглобулинов.
Кому рекомендуется экспресс-тестирование? Министерство здравоохранения России рекомендует пройти тест ИФА:
- пациентам с признаками инфекции,
- людям, контактировавшим с больными коронавирусом,
- людям, которые хотят узнать, переболели ли они Covid-19,
- медицинскому персоналу,
- работникам лабораторий,
- сотрудникам государственных органов.
Через сколько будут известны результаты исследования? В течение 10-15 минут. Скорость – это главное преимущество исследований на антитела, поэтому методы ИФА и ИФЛА остаются одними из самых популярных при диагностике коронавирусной инфекции.
Насколько точно исследование на антитела? Точность методов ИФА и ИФЛА достигает 60-65%. Чаще всего получение ложноотрицательного или ложноположительного результата связано с неправильным забором биоматериала, поэтому обращайтесь только к профессионалам.
Метод LAMP
Метод петлевой изотермической амплификации (LAMP) считается «упрощенной» версией исследования ПЦР.
Относится к тест-системам, при этом производители настаивают на том, что их точность составляет 94%.
Методика LAMP также основана на том, что РНК вируса достраивается до ДНК, а затем происходит копирование при постоянной температуре 65 °C. Исследование проводится в лабораторных исследованиях.
Как проводится LAMP? Чтобы определить Covid-19 этим методом, происходит забор биоматериала из носоглотки. Затем для получения точного результата к нему добавляются праймеры (фрагмент нуклеиновой кислоты) и состав исследуется в лабораторных условиях.
Кому рекомендуется диагностика LAMP? Тем, кто контактировал с лицами, больными Covid-19, а также людям, входящим в группу риска (например, пожилым людям и тем, у кого имеются тяжелые хронические заболевания).
Через сколько будут известны результаты? В течение 20-40 минут. Метод LAMP на данный момент не применяется в государственных лабораториях. Однако его используют в частных клиниках для подтверждения результатов экспресс-тестирования.
Насколько точно исследование LAMP? Данные об эффективности этого метода диагностики отсутствуют. Однако, по мнению многих специалистов, его точность схода с методикой полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Какой способ диагностики лучше?
Все методы, применяемые для выявления Covid-19, успешно применяются в диагностике заболевания. Они отличаются по методу и показаниям к проведению, а также по длительности получения результатов. Однако применяются в разных случаях, поэтому имеют равную эффективность.
Если вы находитесь в тесном контакте с человеком, болеющим коронавирусом, рекомендуется ПЦР-исследование. В отличие от остальных методик оно занимает больше времени, но позволяет получить максимально точные данные.
Если вы хотите узнать, переболели ли уже Covid-19, рекомендуется экспресс-тест на антитела. Он занимает минимум времени и позволяет узнать, на какой стадии развития находится заболевание, и переболели ли вы им раннее (например, если коронавирус прошел в бессимптомной форме).
Если вы входите в группу риска заражения Covid-19, рекомендуется экспресс-тест на антитела или исследование LAMP. Обе методики быстро проводятся и имеют сравнительно высокую эффективность, поэтому вероятность получения ложного результата минимальна.
Полезные рекомендации
Самое важное – это выбрать лабораторию. Обращайтесь только в надежные места, чтобы быть уверенным в точности диагностики. В 2020 году исследования проводят как государственные лаборатории, так и частные клиники. В последнем случае вы можете вызвать специалистов для забора биоматериала на дом и гораздо быстрее получите результаты
Следующий нюанс – это момент сбора биоматериала. Если он будет проведен неправильно, то возрастет риск получения ложного положительного или ложного отрицательного результата. Чтобы этого избежать, необходимо соблюдать некоторые правила:
- За 6 часов до теста полимеразной цепной реакции (ПЦР) запрещается применять спреи, леденцы, таблетки или другие средства для устранения боли или воспаления в горле.
- За 3-4 часа до исследования ПЦР нужно отказаться от еды и воды. Не чистите зубы, не курите, не полощите горло. Это необходимо, чтобы специалист взял биоматериал из носоглотки, пригодный для тестирования.
Если результаты оказались положительными, то не паникуйте. Своевременное обнаружение Covid-19 обеспечивает быстрое лечение. При обращении в частные клиники оно разрабатывается индивидуально, поэтому позволяет быстро побороть вирус и избежать дальнейшего развития инфекции.